RNA ארוך ללא קידוד שמור, GAPLINC, מווסת את התגובה החיסונית במהלך הלם אנדוטוקסי

למידע נוסף אנא צור קשרdavid.wan@wecistanche.com

מַשְׁמָעוּת

דלקת נחקרה במידה רבה בהקשר של גנים מקודדי חלבון. מחקרים אחרונים חשפו את ה- IncRNAs כמווסתים חשובים של חסינות. האפיון התפקודי של גנים אלה נותר תחום מחקר פעיל. במחקר זה, אנו מזהים את GAPLINC כשמר פונקציונליIncRNAבין בני אדם ועכברים. דלדול GAPLINC מביא לביטוי משופר של גנים של תגובה חיסונית שהם ישיריםNF-kBמטרות. באופן מדהים, אנו רואים כי עכברי נוקאאוט של Gaplinc מראים עמידות בפני הלם אנדוטוקסי המושרה על ידי LPS ומוצאים שביטוי בסיסי של גנים דלקתיים מונע היווצרות נקודות כדי להגן מפני כשל רב איברים ומוות. לממצאים אלה יש השלכות בטיפול באלח דם, שבו טיפולים חדשים המכוונים ל- IncRNAs יכולים לתרום מידע רב ערך בהבנת דלקת ושיפור תוצאות המטופל.

לחץ כאן כדי ללמוד עוד על Cistanche

FG 1. זיהוי ואפיון של מקרופאגים ספציפייםIncRNA GAPLINC. (A) A schematic for macrophage differentiation in vitro using primary human celeb or immortalized THP-1 cells, Isolated monocytes from human P8MCs are differentiated into macrophages using recombinant magnon stimulating factor. PHP-1 cells are differentiated into macrophages by treatment with PMA (100 nM). (8)RNA-Seg analysis on macrophages differentiated from monocytes isolated from human PBMCs (n = 4 donors). Results are represented in a volcano plot. GAPUNC (shown in red) is the most up-regulated and RNA (>1,000-פוק). (ג) ניתוח RNA-Seq שלGAPLNCביטוי במהלך התמיינות מונוציטים למקרופאגים עבור נקודות הזמן המצוינות. ביטוי GAPLINC מיוצג כעותקים לכל תא (FPKM. (D) מפת חום מייצגת ביטוי גנים מלוח ננו-מיתרים מותאם אישית, המציגה את 10 ה- InciNA המובילים לביטוי דיפרנציאלי בהשוואה בין מונוציטים למקרופאגים ב תאים אנושיים ראשוניים ותאי THP-1. נתונים מ- Nanotring בוצעו בכפולות ביולוגיות. (E) סכימה של תאי אבות גרנולוציטים-מונוציטים שמביאה לשתי אוכלוסיות שונות: 1)MDDCs ו-2) MDMs. מסלול הדפדפן הגנום של UCSC מציג קריאות RNA-Seq ממונוציטים, מקרופאגים ותאים דנדריטיםGAPLINCלוקוס. () ניתוח qPCR של RNA מטוהרים משברים גרעיניים (לבן) וציטופלסמי (אפור) ב-MDM (ניתוח G qPCR של Russ מבודד משברי פוליזומים שונים של מערכות MDM (10 עד 50 אחוז סוכרוז גרדיאנט, SW41, 40 K rpm, עבור ~ 1.5 שעות).

מחקרים אחרונים זיהו אלפי RNAs ארוכים שאינם מקודדים (ncRNAs) בגנום של יונקים המווסתים את ביטוי הגנים בתהליכים ביולוגיים שונים. למרות ש- IncRNAs זוהו במגוון של תאי חיסון ומעורבים בתגובה חיסונית, התפקוד והמנגנון הביולוגי של רובם נותרים בלתי נחקרים, במיוחד באלח דם. כאן, אנו מזהים תפקיד של hdRNA - אדנוקרצינומה בקיבה מנבא RNA (GAPLINC) לא מקודד בין-גניים - שאופיין בעבר בשל תפקידו בסרטן, כעת בהקשר של חסינות מולדת, מקרופאגים והלם אנדוטוקסי המושרה על ידי LPS. ניתוח טרנסקריפטום של מקרופאגים מבני אדם ועכברים מגלה ש-GAPLINC הוא IndRNA שמור שמתבטא מאוד בעקבות התמיינות מקרופאגים. עם הפעלה דלקתית, GAPLINC מווסת במהירות למטה. מקרופאגים המדוללים מ-GAPLINC מציגים ביטוי משופר של גנים דלקתיים בקו הבסיס, בעוד שביטוי יתר של GAPLINC מדכא תגובה זו. בהתאם לתאים מדולדלים של GAPLINC, עכברי נוקאאוט של Gaplinc מציגים רמות בסיסיות משופרות של גנים דלקתיים ומראים עמידות בפנינגרמת על ידי LPSהלם אנדוטוקסי. מבחינה מכאנית, הישרדות קשורה לרמות מוגברות של NF-xB גרעיני בעכברי נוקאאוט של Gaplinc המניעים ביטוי בסיסי של גני מטרה המופעלים בדרך כלל רק בעקבות גירוי דלקתי. אנו מראים כי הפעלה זו של גנים של תגובה חיסונית לפני אתגר LPS מובילה להיווצרות קרישי דם דה-אזורים, אשר מגנה על עכברי נוקאאוט של Gaplinc מכשל רב איברים ומוות, יחד, התוצאות שלנו מזהות פונקציה לא ידועה בעבר עבור GAPLINC כמווסת שלילי של דלקת ולגלות תפקיד מפתח ל-lncRNA זה בוויסות הלם אנדוטוקסי.

איור 2. GAPLINC הוא מווסת שלילי של דלקת ותלוי באיתות Nf-sB. מונוציטים שבודדו מ-PBMCs אנושיים והתמיינו למקרופאגים הועברו טרנסfected עם בקרה או GAPLINC siRNA. (א)RNA-Seqanalysisעל GAPLINC kd או שליטה siRNA MDMs. RNA-Seq בוצע בכפולות ביולוגיות. התוצאות מיוצגות בחלקת הר געש. גנים מווסתים באופן משמעותי עם שינוי קיפול גדול מ-2 או שווה ל-2 מסומנים באדום. (6) ניתוח GO-Term על גנים מווסתים באופן משמעותי. (ג) מפת חום מייצגת ביטוי גנים של גנים מובילים הקשורים למערכת החיסון המווסתת על ידי GAPLINC kd. נתונים מ-RNA-Seq בוצעו בכפולות ביולוגיות. (D) איזופורמים GAPLINC ב-MDMs נקבעו על ידי רצף R2C2 מבוסס Nanopore. נתונים מרצף Nanopore בוצעו בכפולות ביולוגיות (נתונים גולמיים זמינים ב-SRAunder Bloproject PRINA639136). (ה) טבלה המייצגת ספירות קריאה ואחוז מכל איזופורם GAPLINC. (ו) וקטור דו-כיווני המבטא GFP-Zetocin בצד אחד ו-GAPLINC בצד השני. (G ו-H) ניתוח qPCR של ביטוי GAPLINC בתאי THP-1 המבטאים GAPLINC חוץ רחמי או בקרת וקטור ריקה. רמות של IL6 כומתו בעקבות גירוי עם LPS (200 מ"ל נאל) למשך 6 שעות; נתונים נאספו משלושה ניסויים עצמאיים.*P<0.05. ()="" rna-seq="" analysis="" of="" mdms="" stimulated="" with="" lps(200="" ng/ml)="" for="" the="" indicated="" time="" points.="" data="" from="" rna-seq="" was="" performed="" in="" biological="" duplicates.="" galplinc="" expression="" is="" represented="" as="" copies="" per="" cell="">FPKM), U qPCR ניתוח של GAPLINC ב-MDMs （n=3）טופלו מראש עם DMSO או BAY-7082（10μM）, ואחריו גירוי LPS (200 ngmL) עבור 6 ht נתונים נאספו משלושה ניסויים עצמאיים. *פ<0.05. (k)atacseq="" analysis="" of="" monocytes="" and="" macrophages,="" untreated="" and="" treated="" with="" lps="" (200="" ng/ml)="" for="" 1,6,="" and="" 18h.ucsc="" browser="" track="" displays="" atac-seq="" reads="" at="" the="" gaplinc="">

אלח דם היא מחלה מסכנת חיים הנגרמת מתגובת יתר של הגוף לנוכחות זיהום, שעלולה להוביל במהירות לאי ספיקת איברים ולמוות. מערכת החיסון חיונית במתן הגנה מפני זיהום; עם זאת, להפעלה בלתי מבוקרת יכולה להיות השלכות חמורות על המארח. על פי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן, לאחד מכל שלושה חולים שמתים בבית חולים יש אלח דם (1). ובכל זאת אנחנו עדיין לא מבינים את המנגנונים המולקולריים הבסיסיים שמובילים למוות. האפשרויות הקליניות לטיפול באלח דם מוגבלות למתן נוזלים, אנטיביוטיקה וטיפול תומך ונשארו כמעט ללא שינוי במשך עשרות שנים. למרות שאבחון מוקדם וטיפול מהיר שיפרו את תוצאות האלח דם (2), יש צורך קריטי בפיתוח טיפולים חדשים. למרות שמחקרי ביטוי גנים בוצעו כדי לבחון מטרות טיפוליות פוטנציאליות לאלח דם, מטרות אלו נותרו ברובן בלתי מאופיינות(3). זיהינו RNA לא מקודד ארוך (lncRNA) עם תפקידים בשליטה על התגובה החיסונית והלם אנדוטוקסי המספק דרכים לפיתוח תרופה חדשה למטרת אלח דם.

תוֹצָאָה

איור 3. GAPLINC נשמר בעכברים ומווסת את התגובה להלם אנדוטוקסי. (4) GAPLINC נשמר בסברות. GAPLINC ממוקם על Chr18 בבני אדם ועל Chr17 בעכברים, בין הגנים המקודדים לחלבון Dlgap1 ו-Gift. Dlgapil אינו מתבטא במקרופאגים. (B)MCA מראה את התפלגות רמות Gaplinc בסוגי תאי חיסון שונים (BM). (ג) ניתוח qPCR של ביטוי Gaplinc בתאי B ו-BMDMs; נתונים אלה (ממוצע ± SD) מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים, (D) ניתוח qPCR של ביטוי Gaping ב-BMDME מעורר עם LPS (200 na/mL) למשך 6 שעות; נתונים אלה (ממוצע ± SD) מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. (ה) סכמטי של לוקוס Gaplinc לפני ואחרי מחיקה בתיווך CRISPRCas9. קווים מקווקווים מציינים את האזור המשוער של המחיקה. ג'ל מייצג הגברה של PCR של נתונים גנומיים. אורכי אמפליקון מושווים עבור עכברי WT ו-Gaping KO, (F) ניתוח qPCR של ביטוי Gaplinc ב-WT ו- Gaplinc-KO BMDMs באמצעות שילוב של פריימרים לזיהוי Exon1, Exon2 ו-Exon-PCR אזורים של התעתיק Gaplinc; נתונים אלה (ממוצע ± SD) מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ניתוח (G) RNA-Seq ב-BMDMs מעכברי WT ו- Gaplinc KO (n =3). התוצאות מיוצגות בחלקת הר געש. גנים מווסתים באופן משמעותי עם שינוי קיפול גדול מ-2 או שווה ל-2 מוצגים באדום. (ח) ניתוח GO-Term על גנים מווסתים באופן משמעותי. (I ו-J) נתוני הישרדות של עכברי WT ו-Gaplinc KO מוצגים בתגובה לאתגר E. coli LPS (5 מ"ג/ק"ג/עכברים) (n =6 עד 10). המבחן הסטטיסטי של ההבדלים נספר באמצעות מבחן ה-log-rank (Mantel-Cox). "...פ< 0.001.="" changes="" in="" body="" temperature="" of="" wt="" and="" gapline="" ko="" mice="" were="" recorded="" at="" the="" indicated="" time="" points.="" (k)="" survival="" data="" of="" wt="" and="" gaplinc="" ko="" mice="" are="" shown="" in="" response="" to="" the="" e.="" coli="" lps="" challenge(20="" mg/kg/mice)(n="10)." the="" statistical="" test="" of="" differences="" was="" calculated="" using="" the=""><>

מכיוון שביטוי lncRNA יכול לווסת את התגובה החיסונית על ידי השפעה על התמיינות תאי חיסון ותפקודם בהתאמה (4-7), רצינו לחקור את תפקידם של ncRNAs במקרופאגים. מקרופאגים הם תאי חיסון מולדים חשובים שניתן להפיק ממונוציטים והם קריטיים לזיהוי פתוגנים באמצעות שימוש בקולטנים דמויי Toll (TLR). לאחר הפעלה. TLRs יוזמים מסלולי איתות מורכבים המפעילים גורמי שעתוק מרכזיים כגון NF-kB. המובילים לתעתוק של מאות גנים של תגובה חיסונית(8).

כדי לזהות IncRNAs המעורבים בהתמיינות ותפקוד מקרופאגים, ערכנו רצף RNA (RNA-Seq)בשני מקרופאגים ראשוניים (MDMs) שמקורם במונוציטים אנושיים ובקו התאים המונוציטי THP-1s (איור lA ו-SI נספח. איור S1). זיהינו RNA אדנוקרצינומה בקיבה (GAPLINC) מנבא ארוך intergenic noncoding כ-IncRNA המווסת ביותר במהלך התמיינות מונוציטים למקרופאגים (איור 1B). רמות GAPLINC היו ניתנות לזיהוי ביום 1 ועלו ל-~300 עותקים לתא (איור 1C). באמצעות טכנולוגיית פרופיל RNA (nCounter, Nanostring), אימתנו את GAPLINC כאחד מ-10 ה-mRNA המובילים המתבטאים ב-MDM ראשוני מובחן ו-THP-1 (איור 1D). כמו כן, אישרנו ש-GAPLINC מתבטא מאוד ב-MDMs אך אינו מתבטא בתאים הדנדריטיים (MDDCs) (איור 1E) הקשורים קרובים לסוג התא, מה שמרמז על ביטוי זה של GAPLINC הוא ספציפי לסוג תא. על ידי ביצוע ניסוי חלוקה של תאים ומדידת רמות GAPLINC בתאים הציטופלזמיים והגרעיניים של מקרופאגים באמצעות qPCR, מצאנו ש-GAPLINC ממוקם בעיקר בציטוזול בהשוואה ל-CD14, mRNA ציטופלזמי, ו-NEAT1, IncRNA גרעיני (איור. 1F). זה עולה בקנה אחד עם ממצאים בתאי סרטן, שבהם GAPLINC ממוקם בעיקר לציטופלזמה(9). כדי להבטיח ש-GAPLINC אינו מקודד, ביצענו polysome pro-filing, שיטה המשמשת לניתוח האם גן מתורגם באופן פעיל לחלבון. בניגוד ל-CD14, לא NEATI ולא GAPLINC נמצאו בשבר הפוליזום הגבוה, מה שמרמז ש-GAPLINC אינו מתורגם (איור 1G),

איור.4. Gaplnc KO מווסת את IRGs ומראה רמה מוגברת של p65 בעירום בקו הבסיס. (א) רמות ציטוקינים בסרום של עכברי WT ו-Gaplinc KO ב-basal.n=4 עד 7,*P<0.05.(b and="" c)rna-seg="" analysis="" in="" bmdms="" from="" wtand="" gaplinx="" ko="" mice="" stimulated="" with="" lps="" (200naiml)for6h="" (n="3)." the23aenes="" up-regulated="" in="" gap/inc="" ko-only="" condition="" are="" compared="" to="" wt="" and="" gapfinc-ko="" bmdms="" stimulated="" with="" lps.="" the="" resulting="" fold="" change="" upon="" lps="" stimulation="" is="" shown="" for="" wt="" and="" gapinc-ko="" bmdms.genes="" are="" ranked="" according="" to="" their="" fold="" change="" in="" wt.="" (d)="" coagulation="" parameters="" assessed="" for="" wt="" and="" gapinc="" ko="" mice="" challenged="" ip.with="" e.="" coils(5mg/kg/mice)(n="4" to="" 5).plasma="" was="" collected="" 18h="" post-lpsiniection.="" aptt="" was="" measured.="" (e)genes="" upregulated="" non="" sirna="" kd="" of="" human="" gaplnc="" in="" mdms="" are="" compared="" to="" genes="" up-regulated="" upon="" crsprcas9="" knockout="" of="" mouse="" gaplincin="" bmdms="" (fold="" change="" ≥1.5).="" up-regulated="" genes="" overlapping="" in="" both="" humans="" and="" mice="" are="" shown="" in="" the="" middle.="" (f)="" western="" blot="" of="" kb-gin="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" at="" the="" indicated="" time="" points="" following="" stimulation="" with="" lps="" (200="" ngml);="" these="" data="" are="" representative="" of="" three="" independent="" experiments,(g)="" western="" blot="" of="" p65="" in="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="3)" at=""><0.01. (h="" western="" blot="" of="" p65="" in="" the="" nuclear="" fraction="" of="" wt="" and="" gaplinc-ko="" bmdms="" (n="">

לאחר מכן, חקרנו את ההשפעה של השתקת GAPLINC על מקרופאגים מבדילים. ככל שרמות ה-GAPLINC עלו במהלך ההתמיינות, שיערנו ש-GAPLINC knock-down (KD) ישפיע על גנים המעורבים בהתמיינות. באמצעות RNA מפריע קטן (siRNA), השגנו ~ 55 עד 65 אחוז kd של GAPLINC ב-MDMs ראשוני (SIAppendix, איור S2). ביצענו RNA-Seq וזיהינו מספר גנים שהיו חסרי ויסות ב-GAPLINC kd (איור 24). אישרנו את הלהיטים המובילים באמצעות Nanostring (נספח SI, איור S3). ניתוח העשרה של Gene Ontology (GO) הראה שגנים של תגובה חיסונית היו מיוצגים באופן משמעותי בגנים המווסתים על GAPLINC kd ולא גנים המעורבים בהתמיינות מקרופאגים, בניגוד להשערה המקורית שלנו. (איור 2B). יש לציין כי גנים המובעים בצורה דיפרנציאלית בתאי GAPLINC-KD כוללים ציטוקינים פרו-דלקתיים וכימוקינים (IL6, CXCL10 ו-TNFSF10), גנים מעוררי IFN (ISGs) (IFIT2 ו-RSAD2), וחלבונים קושרי גואנילט (GBPs) (GBP3 ו-GBP5) (איור 2C ו-SI נספח. איור S4). כדי לוודא שהתמיינות מקרופאגים לא הושפעה מ-GAPLINC kd. רמות CD11B.CD16 ו-CD14 נמדדו במקרופאגים שטופלו בשליטה ובאותות ונמצאו דומות (נספח SI. איור S5). לאחר מכן, השתמשנו בגישת kd נוספת תוך שימושCRISPRעיכוב (CRISPRi) למקד לאתר התחלת התעתיק על ידי GAPLINשימוש בשלושה RNA מנחה שונים (gRNAs) בתאי THP-1 מגורים עם פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA). השגנו מעל 80 אחוז קילוגרם של GAPLINC ושוב נצפה בביטוי מוגבר של הציטוקין הפרו-דלקתי IL6 כאשר GAPLINC מופל בקו הבסיס (נספח SI. איור S6 A ו-B). מעניין לציין שבעקבות הפעלת ליפופוליסכריד (LPS), רמות ה-IL6 היו דומות בתאי הביקורת לעומת GAPLINC kd THP-1 (SIAppendix, איור S6C). מכיוון שרמות הבסיס שונות, השראת הקפל הכוללת של IL6 מצטמצמת כאשר GAPLINC מוסר. (נספח S7, איור S6D).

מכיוון ש-GAPLINC kd הביא לוויסות-על של גנים של תגובה חיסונית, יצרנו שורת תאים THP-1 המבטאת יתר את GAPLINC כדי לקבוע אם היא מתווך את ההשפעה ההפוכה. שימוש בנתוני רצף לקריאה ארוכה. זיהינו את האיזופורמים הדומיננטיים של GAPLINC המבוטאים ב-MDMs (איור 2D). האיזופורם השופע ביותר, התואם את ביאור הגן של Reference Sequence (RefSeq), שולב במבנה שלנו (איור 2E). השתמשנו בוקטור lentiviral המכיל מקדם דו-כיווני כדי להניע חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)/Zeocin ו-GAPLINC במקביל (איור 2F). אישרנו באמצעות qPCR ש-GAPLINC בא לידי ביטוי ביציבות ב-THP-1 בהשוואה לבקרה (איור 2G). ביטוי יתר של GAPLINC הפחית IL6 ברמת RNA בהשוואה לבקרה בעקבות גירוי עם LPS, מרכיב של חיידקים גרם שליליים (איור 2H). תצפיות אלו מצביעות על כך ש-GAPLINC פועל כמווסת שלילי של התגובה הדלקתית.

לאחר מכן, בדקנו את רמות GAPLINC ב-MDM ראשוני בתגובה לדלקת. עם גירוי LPS, מצאנו ש-GAPLINC היה מווסת במהירות למטה (איור 2I). בנוסף, באמצעות qPCR אנו מראים ש-GAPLINC מווסת גם מטה בעקבות הפעלה עם מגוון שלTLRליגנדים (נספח SI, איור S7A). אושרה אינדוקציה של גנים דלקתיים בעלי ביקורת חיובית TNF-a, IL6 ו- CCL5 (נספח SI, איור S7B). נתונים אלו מצביעים על כך שביטוי GAPLINC חייב להיות מופחת בעקבות גירוי על מנת להתרחש אינדוקציה אופטימלית של גנים דלקתיים. כדי להעריך את התפקיד של NF-kB בשליטה על הביטוי של GAPLINC, MDMs טופלו מראש עם דימתיל sulfoxide (DMSO) או BAY11-7082, מעכב NF-B,

ואחריו גירוי עם LPS למשך 6 שעות. ב-MDM שטופלו ב-BAY11-7082-. הורדת הוויסות של GAPLINC נפגעה ביחס לבקרה (איור 2/). מה שמרמז שהוויסות של GAPLINC תלוי באיתות NF-KB. אושרה אינדוקציה של גנים דלקתיים בעלי בקרה חיובית TNF- ו-IL6 לאחר גירוי LPS (SIAppendix, איור, S7C). כדי להבין כיצד מוסדר GAPLINC, השתמשנו ב-Asay for Transposase-Accessible Chromatin באמצעות רצף (ATAC-seq) ב-MDMs כדי להעריך את נגישות הכרומטין של לוקוס GAPLINC. מצאנו ש-GAPLINC מתומלל באופן פעיל במקרו-פאגים במנוחה אך נסגר היטב בעקבות גירוי LPS (איור 2K), מה שמרמז על כך ש-GAPLINC מוסדר ברמת השעתוק.

לחקור את השימור של GAPLINC בין בני אדם ועכברים. ביקשנו לזהות לוקוסים סינטניים, שבהם גנים נשמרים במיקום בין אותם שני גנים מקודדי חלבון. ולאחר מכן הערכה לשימור תפקודי. כאן, אנו מראים ש- Gaplinc נשמר מיקום, מאתר תמליל בין הגנים Dlgap1 ו- TgifI (איור 3A). כדי לאשר את הספציפיות של סוג התא, השתמשנו ב- Mouse Cell Atlas (MCA)

(10) כדי להעריך את רמות התעתיק על פני תאי מערכת החיסון במח העצם (BM) ומצא אותו בא לידי ביטוי הגבוה ביותר במקרופאגים, עם רמות נמוכות יותר של ביטוי באבות נויטרופילים (איור 3B). לאחר מכן, כדי לקבוע אם דפוסי ביטוי נשמרו במהלך התמיינות מקרופאגים גם בבני אדם וגם בעכברים, ביצענו RNA-Seq השוואה בין תאי BM למקרופאגים שמקורם במח עצם (BMDMs), השלימו את הרכבת התמלול דה נובו, ומצאנו שרמות Gaplinc של עכברים עלו בעקבות התמיינות (נספח SI, איור S8A). אימתנו זאת על ידי qPCR, תוך השוואת רמות Gaplinc בתאי BM ל-BMDMs (איור 3C). ניתן להשוות ל-GAPLINC האנושי. העכבר Gaplinc מווסת במהירות מטה ב-BMDMs בגירוי LPS (איור 3D). כבקרה, אישרנו את השראת הגנים הדלקתיים The-a ו-I6 (נספח SI. איור S8B). Mouse Gaplinc גם מווסת במהירות למטה בעקבות הפעלה עם ליגנים שונים של TLR. אינדוקציה של גנים בקרה חיובית ll6 ו- Ccl5 אושרו גם כן (נספח SI, איור S8C).

באמצעות CRISPR, יצרנו עכבר נוקאאוט של Gaplinc (KO) שבו הוסרו Exon I ורוב האינטרון הראשון (איור 3E). עכברי צ'פלין KO התרבו כרגיל ולא הראו פגמים התפתחותיים ברורים. המחיקה של Gapline אושרה על ידי הגברה PCR של DNA גנומי בעכברי פרא (WT) ו-Gaplinc KO, עם גדלי אמפליקון ~1,300 bp עבור WT ו~500 bp עבור עכברי Gaplinc KO (איור 3E), אסטרטגיית הגנוטיפים המלאה כדי לאשר KOs WT ו- Gaplinc מודגש בנספח SI, איור S9. אישרנו גם מחסור ב-Gaplinc ב-BMDMs באמצעות qPCR (איור 3F). כדי להעריך אם מחסור ב-Gaplinc השפיע על ההתמיינות, צבענו WT ו- Gaplinc-KO BMDMs עבור CD11B ו-F4/80; דפוסי צביעה היו דומים, דבר המצביע על התמיינות מקרופאגים רגילה (נספח SI, איור S104). כדי להעריך אם Gaplinc KO שיבש את תפקוד המקרופאגים, השוו את פעילות הפגוציטוזיס ב-WT ו- Gaplinc-KO BMDMs ולא מצאנו הבדלים (נספח SI, Fig.S10B).

כדי להעריך את ההשפעה הגלובלית של מחסור ב-Gaplinc במקרופאגים, ביצענו RNA-Seq על WT ו- Gaplinc-KO BMDMs; שניהם לא טופלו ו-LPS מגורה במשך 6 שעות. ב- Gaplinc-KO BMDMs, הביטוי של 23 גנים (המוצגים באדום. איור 3G) היה מווסת משמעותית בקו הבסיס. גנים אלה כוללים ציטוקינים פרו-דלקתיים וכימוקינים (Il6.l1-a. I1-8,ו-Cxd10),ISGs(Ifitlbl1), בני משפחה של GBP(Gbp5 ו-Gbp0),ו סמני משטח תא ספציפיים עבור מקרופאגים משופעלים (Cd69). ניתוח GO אישר כי גנים המעורבים בתגובה החיסונית מיוצגים יתר על המידה ב- Gaplinc-KO BMDMs בקו הבסיס (איור 3H). גנים אלה בדרך כלל מווסתים למעלה בעקבות גירוי LPS (נספח SI. איור S11). בדומה לנתונים שהתקבלו ממחקרים אנושיים שלנו, נתונים אלה מצביעים על כךGAPLINCנשמר פונקציונלית על פני מינים כדי לשלוט באופן בסיסי בביטוי של גנים בתגובה דלקתית (IRG). לא היה הבדל מהותי בגנים שהווסטו למעלה בעקבות גירוי LPS בין WT ו- Gaplinc-KO BMDMs (Dataset S1).

מחקרים רבים הראו את היכולת של IncRNAs לווסת את השעתוק של גנים שכנים (11). ככזה, חקרנו תפקידי cis-רגולציה פוטנציאליים עבור Gaplinc שכן הגן השכן שלו, Tgif1, היה מעורב בעבר באפנון הפעלת מקרופאגים (12). באמצעות נתוני ה-RNA-Seq שלנו, אישרנו שב-GaplincKO BMDMs, הביטוי של Tgifl ביחס לתאי T לא הושפע (SIAppendir.Fig.S124). אישרנו עוד על ידי qPCR ש-Tgifl לא השתנה ב-Gaplinc-KO BMDMs (נספח SI, איור S12B). לאחר מכן, בדקנו את האפשרות ששיבוש המיקום של Gaplinc יכול להסיר אלמנט רגולטורי חשוב, כגון משפר. השתמשנו בנתוני ATAC-seq מ-WT BMDMs כדי להעריך אזורים פעילים תעתיק בלוקוס Gaplinc (13). לא זיהינו אותות בתוך אזור המחיקה של Gaplinc, רק אלה התואמים את האמרגן של Gaplinc (נספח SI. Fig.S13). באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על כך שוויסות-על של IRGs על מחסור ב- Gaplinc אינו נובע מהשפעות על גנים שכנים או הסרה של אלמנט רגולטורי.

מכיוון ש-Gaplinc KO ב-BMDMs מסדיר את הביטוי של IRGs בתנאים בסיסיים, בשלב הבא רצינו לאתגר את בעלי החיים של Gaplinc KO in vivo כדי לצפות בהבדלים בתגובת המארח. השתמשנו במודל "הלם אנדוטוקסי". שבו Escherichia coli LPS הוזרק תוך-פריטונאלי (ip) לעכברי WT ו- Gaplinc KO כדי למדוד הבדלים בהישרדות. במינון של 5 מ"ג/ק"ג/עכבר. עכברי WT הראו 0 אחוזי הישרדות לאחר 2 ד' (איור 30. עם זאת, 100 אחוז מעכברי Gaplinc KO שרדו, sg מה שגורם לעכברי Gaplinc KO יש עמידות להלם אנדוטוקסי המושרה על ידי LPS (איור 31). נצפים הבדלי טמפרטורה משמעותיים בין WT ועכברים חסרי Gaplinc (איור 3). גם כאשר משתמשים במינון גבוה בהרבה של LPS של 20 מ"ג/ק"ג, העכברים חסרי Gqplinc מציגים יתרון הישרדות משמעותי (איור 3K). ביחד , נתונים אלו מראים כי לגאפלינק תפקיד חשוב בוויסות התגובה החיסונית in vivo.

ממחקרים אנושיים שלנו, אנו יודעים ש-GAPLINC יכול לווסת גנים חיסוניים בקו הבסיס. אמנם אין הבדל בביטוי ציטוקינים בעקבות הפעלה דלקתית, אך יש הבדל בגודל התגובה מכיוון שרמות הבסיס שונות, לכן, כדי להבין טוב יותר את הבדלי ההישרדות הללו in vivo, הערכנו שינויים בביטוי הציטוקינים בתחילת הדרך. השתמשנו במערך ציטוקינים מרובה כדי למדוד בו-זמנית סמנים ביולוגיים הקשורים לתגובה חוזרת של מערכת החיסון, אלח דם וסרטן. בקו הבסיס, גנים חיסוניים מרכזיים כולל MDC. MIP-1a.IL-13. IL-5. ו-M-CSF היה מוגבר באופן משמעותי בסרום של עכברי Gqplinc KO בהשוואה ל-WT (איור 44). ציטוקינים אלה מעורבים בגיוס תאים: עם זאת, באמצעות ציטומטריית זרימה, אישרנו שאחוז הנויטרופילים, תאי T, תאי B, אאוזינופילים, מונוציטים ומקרופאגים היו דומים בין WT ו- Gaplinc KOMice בקו הבסיס (נספח SI, איור S14) . מעניין לציין שאחוזים אלו היו דומים גם לאתגרים שלאחר LPS בנקודות הזמן של 6 שעות ו-18 שעות (נספח SI, איורים S15 ו-S16). יתר על כן, סרום מעכברי WT ו-Gaplinc KO שנבדקו לאיתור מאפיינים קליניים של אלח דם, כולל לקטט וחלבון C-reactive (CRP) (נספח S7, איור S17), לא הראו הבדלים

מכיוון שרמות מוגברות של MDC או IL-13(איור 44) אופיינו בעבר כממלאות תפקידי הגנה מפני הלם אנדו-טוקסי באמצעות אפנון של ציטוקינים פרו-דלקתיים (14,15), בשלב הבא בדקנו את ההבדלים ברמות הציטוקינים הפרו-דלקתיים. , כולל l6, Il1-, l1- ו-Cxcl10, בעקבות הפעלה דלקתית. בעוד שרמות ה-WT ו-Gaplinc KO זהות הן ברמת התעתיק (איור 4B) והן ברמת החלבון (נספח SI, Fig.S18A-C), עוצמת השינוי נמוכה בהרבה (איור 4C), מה שמצביע על כך שהקיפול המופחת הזה שינוי עשוי למלא תפקיד במניעת הרגישות של עכברי Gaplinc KO ל-LPS. הלם אנדוטוקסי גורם.

יחד עם הייצור המשתולל של ציטוקינים. היבט קליני נוסף של הלם אנדוטוקסי שעלול להוביל לתמותה הוא היווצרות קרישי דם בכלי הדם הקטנים יותר, מה שמוביל לאי ספיקת איברים רבים (16.17). כדי לטפל בזה, ניתחנו את הסרום של עכברים שטופלו ב-LPS ip. כדי להעריך הבדלים בקרישה. באמצעות בדיקת זמן (א) טרומבופלסטין חלקי מופעל המודד את הזמן עד להיווצרות קריש, אנו מוצאים שעכברי WT מראים זמן ממושך משמעותית בהשוואה לעכברי Gaplinc KO לאחר אתגר LPS (איור 4D). זמני aPTT ממושכים מצביעים על כך שעכברי WT כבר עברו קרישה ודלדלו גורמי קרישה מרכזיים, כך שבזמן הבדיקה, התחלת הקרישה והמדידה, הזמן עד להיווצרות קריש גדל. הנתונים מצביעים על כך שהבדלים בהישרדות עם אתגר LPS נובעים מכך שעכברי WT עוברים קרישה מוגברת, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת איברים ומוות.

לאחר מכן, ניסינו להבין באופן מכניסטי כיצד Gaplinc מתווך את האפקט הזה. ראשית, אישרנו את הלוקליזציה שלו וניתחנו את רמות Gaplinc הן בתאים הציטופלזמיים והן בתאים הגרעיניים של BMDMs על ידי qPCR. דומה ל-GAPLINC האנושי. העכבר Gaplinc היה בעיקר ציטופלזמי (נספח ST, איור S19). לאחר מכן, ביצענו זיהוי מקיף שונה של חלבונים קושרי RNA (ChIRP), בשילוב עם ספקטרומטריית מסה ורצף RNA קטן, שכן הוכח בעבר כי GAPLINC מקיים אינטראקציה עם מיקרו RNAs (18). לא צפינו באינטראקציות עם מטרות שזוהו בעבר (SIAppendix, איור S20).

מכיוון שלא הצלחנו לזהות שותף מקשר ישיר, התמקדנו בתפקוד המשומר בין בני אדם לעכברים, במיוחד בגנים המשמרים שהושפעו במחקרי GAPLINC kd האנושי שלנו ו-Gaplinc KO של עכברים, שרובם הם מווסתים של NF-kB (איור 4E) ). הצורה הנפוצה ביותר של NF-KB המופעלת על ידי LPS היא ההטרודימר p65:p50, ושבעה מתוך תשעת הגנים שנשמרו הם מטרות p65 ישירות(19). השתמשנו ב-Native RNA immunoprecipitation (RIP) והראינו שאין אינטראקציה ישירה בין Gaplinc ל-p65(S7 Appendix, Fig. S21). במסלול האיתות הקלאסי NF-kB, יחידות המשנה p6:p50 ממוקמות בציטוזול וקשורות לעכב את I-kB- בתאים מנוחה. עם ההפעלה, I-KB- מתכלה, מה שמאפשר ל-p65:p50 לעבור לגרעין ולהפעיל גני מטרה (20). ב-WT ו-Gaplinc-KO BMDM, מדדנו את השפלה של I-kB- באמצעות Western blot ולא מצאנו הבדלים (איור 4F). לאחר מכן, השווינו את רמות ה-p65 הכוללות ב-BMDMs. בנתוני RNA-Seg שלנו, רמות התעתיק של p65(RelA) הן בתנאים הבסיסיים והן ב-LPSstimulated עבור WT ו- Gaplinc-KO BMDMs דומות (נספח SI, איור S22). עם זאת, כאשר השוו את רמות החלבון הכוללות של p65 על ידי Western blot, מצאנו רמות גבוהות משמעותית של p65 ב-Gaplinc-KOcells בהשוואה ל-WT (איור 4G). זה מצביע על כך ש-Gaplinc מווסת את רמות ה-p65 הכוללות ברמת התרגום. בנוסף, הערכנו את רמות ה-p65 בתאים הציטופלזמיים והגרעיניים ומצאנו ש-p65 גרעיני נמצא בשפע יותר בתאים חסרי Gaplinc בהשוואה ל-WT (איור 4H). יחד, נתונים אלה מצביעים על תפקיד מכניסטי ל-GAPLINC בהפעלת ההפעלה של IRGs קריטיים.

דִיוּן

כאן, זיהינו את GAPLINC כ- IncRNA המבוטא ציטוזולי משומר בבני אדם ועכברים שמתפקד לשלוט בביטוי גנים דלקתי באמצעות ויסות של NF-xB. בהשוואה ל-CRNA ציטוסוליים מדווחים המשפיעים על יעילות התרגום על ידי אפנון ביטוי חלבון או הרכבת ריבוזומים (21-23), אנו מוצאים ש-Gapline תורם ציטוסולית ליכולת התרגום של p65; עם זאת, מנגנון האינטראקציה, ישיר או עקיף, עדיין לא נקבע. הממצאים שלנו מספקים תובנות לגבי האופן שבו IncRNA שמור באופן תפקודי מסדיר את התגובה החיסונית ומספקים דרכי חקירה לפיתוח תרופות לטיפול בהלם אנדוטוקסי.