מחקר 13-שבועי על רעילות תת-כרונית של 2-(l-menthoxy)ethanol בחולדות F344

תקציר: 2-(l-Menthoxy)ethanol שימש לעתים קרובות כחומר טעם; עם זאת, הנתונים לגבי רעילות 2-(l-menthoxy)ethanol נותרו מוגבלים. ביצענו 13-שבוערעילות תת כרוניתמחקר של {{0}}(l-menthoxy)אתנול בחולדות F344 זכר ונקבה, עם מינונים של 0, 15, 60 או 250 מ"ג/ק"ג משקל גוף (BW)/יום שניתנו דרך הפה באמצעות מתן מתן שמן תירס בתור הרכב. לא נצפו שינויים טוקסיקולוגיים משמעותיים במצב הכללי, במשקל הגוף או בצריכת המזון באף קבוצה. ההערכה ההמטולוגית הראתהירידה בהמוגלובין,המטוקריט, נפח גופי ממוצע, והמוגלובין גופני ממוצע וספירת טסיות מוגברת בקבוצת הגברים של 250 מ"ג/ק"ג.ביוכימיה בסרוםגילהעלייה בכולסטרול הכוללבקבוצת 250 מ"ג/ק"ג של חולדות זכרים ונקבות, הפחתה בטריגליצרידים בקבוצת הנקבות של 250 מ"ג/ק"ג, ועלייה בסך החלבון בקבוצת הזכרים של 250 מ"ג/ק"ג, מה שמצביע על השפעות עלחילוף חומרים שומניםוסינתזת חלבון. עבור משקלי איברים, המשקל המוחלט והיחסי של בלוטות הכבד ובלוטת יותרת הכליה הוגדל בקבוצת 250 מ"ג/ק"ג משני המינים ובקבוצת הגברים 250 מ"ג/ק"ג, בהתאמה. ניתוח היסטופתולוגי הראהנפרופתיה כרוניתבקבוצות גברים של 15 מ"ג/ק"ג ומעלה, עם עלייה במשקל מוחלט ויחסי של כליות, כמו גם עלייה בקריאטינין בסרום, בקבוצות של 60 ו-250 מ"ג/ק"ג לגברים. עם זאת, גרגירים אאוזינופיליים המכילים 2u-globulin זוהו באבוביות פרוקסימליות, מה שמצביע על נפרופתיה של 2u-globulin ספציפית לחולדות זכרים וללא משמעות טוקסיקולוגית. תוצאות אלו הצביעו על כך שרמת ההשפעה השלילית של 2-(l-methoxy)ethanol לא נצפתה הייתה 60 מ"ג/ק"ג גוף משקל ליום לשני המינים. (DOI: 10.1293/tox.2020-0091; J Toxicol Pathol 2021; 34: 309–317)

מילות מפתח: 2-(l-menthoxy)ethanol, 2-l-menthoxyethanol, תוסף מזון, חומר טעם, עכברוש פישר, מנטול

תוסף Cistanche תוסף תפקוד כליות PhGs75% Ech 30% Act 12%

מבוא

{{0}}(l-Menthoxy)ethanol (CAS מס' 38618-23-4) הוא נוזל שקוף וחסר צבע בעל ריח אופייני ונמצא בשימוש נרחב כחומר טעם. ועדת המומחים המשותפת של FAO/WHO לתוספי מזון (JECFA) העריכה את 2-(l-menthoxy)ethanol כחומר טעם, מסווג כחומרים הקשורים מבחינה מבנית למנטול1. בהתבסס על המחלקה המבנית של חומרי הטעם, 2-(l-menthoxy)ethanol הוקצה ל-Class I. בארצות הברית ובאירופה, רמות הצריכה של 2-(l-menthoxy)ethanol על ידי בני אדם נאמדו ב-12 ug/אדם ליום ו-0.01 ug/אדם/יום, בהתאמה, שניהם מתחת לסף Class I של 1,800 ug/אדם ליום. בהתבסס על הערכות אלו, ההערכה היא כי 2-(l-menthoxy)ethanol עשוי שלא להוות דאגות בטיחותיות במהלך שימוש שגרתי כחומר טעם.

As part of the risk assessment, it has been revealed that 2-(l-menthoxy)ethanol was not mutagenic in the Ames test, and the only in vivo study performed to date was an oral acute toxicity study in male and female rats (LD50: >2,000 מ"ג/ק"ג משקל גוף [BW])1. למרות השימוש ב-2-(l-men thoxy)ethanol כחומר טעם, נתונים מוגבלים זמינים לגבי הרעילות במינון חוזר של תרכובת זו. המעבדה שלנו חקרה את הרעילות של מספר תוספי מזון, כולל חומרי טעם מייצגים מכל קטגוריה, בדגמי מכרסמים 2-7. כדי להבהיר את הפרופיל הטוקסיקולוגי ולקבוע רמת אפקט שלילי ללא נצפית (NOAEL), ערכנו מחקר רעילות תת-כרונית של 13-שבוע של 2-(l-menthoxy)ethanol, אשר ניתנה דרך הפה ל חולדות F344 על ידי מתן מתן.

חומרים ושיטות

כימיקל בדיקה

2-(l-Menthoxy)ethanol (חלקה מס' 5I0002, טוהר 99.9%) מיוצר על ידי Takasago Int. קורפ (טוקיו, יפן) סופק על ידי החטיבה לתקנים והערכה, המחלקה לבטיחות מזון, משרד הבריאות, העבודה והרווחה, יפן, בתמיכת איגוד חומרי הטעם והריח של יפן (טוקיו, יפן). למרות שהחומר הנבדק סופק כתערובת של איזומרים אופטיים (CAS מס' 38618-23-4), הוא אושר כ-l-enantiomer (CAS מס' 75443-64-0) ​​על ידי היצרן. מתן מתן דרך הפה עם שמן תירס (Wako Pure Chemical Industries, אוסקה, יפן) ככלי הרכב נבחר כנתיב מתן הודות לחוסר המסיסות והתנודתיות המימית של 2-(l-menthoxy) אתנול. תמיסות של 2-(l-menthoxy)ethanol הוכנו מדי יום, מיד לפני המתן. לאחר אחסון למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר, היחסים הנותרים של 2-(l-menthoxy) אתנול בתמיסה של 4, 40 ו-400 מ"ג/מ"ל אושרו כ-96.8%, 99.8% ו-96.5%, בהתאמה, על ידי כרומטוגרפיה גז (איגוד הפיקוח של יפן לאיכות הסביבה של תעשיית המזון והמזון, טוקיו, יפן).

חיות ניסוי

בסך הכל, 40 זכרים ו-40 נקבות חולדות נטולות פתוגנים ספציפיים (F344/DuCrlCrlj, 5-בת שבוע) נרכשו מ-Charles River Laboratories Japan (Yokohama, יפן) והשתמשו בהם לאחר התאקלמות במשך שבוע אחד. במהלך המחקר, בעלי חיים שוכנו בכלובי פוליקרבונט עם מצעי שבב רך, שנשמרו בחדר עם מערכת מחסום לשליטה במחזור האור/חושך (12 שעות), אוורור (קצב חילופי אוויר של 18 פעמים/שעה), טמפרטורה ( 24 ± 1 מעלות), ולחות יחסית (55 ± 5%). הכלובים ומצעי השבבים הוחלפו פעמיים בשבוע. לכל חיה הייתה גישה חופשית למי ברז ולתזונה בסיסית (CRF-1; שמרים מזרחיים, טוקיו, יפן). בתחילת הניסוי, החיות חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות של 10 חולדות זכר ונקבה כל אחת, על סמך משקלי הגוף שנמדדו מיד לפני תחילת הטיפול בכימיקל הנבדק.

ללמוד עיצוב

במחקר ראשוני של {{0}}יום של 2-(l-menthoxy) אתנול במינונים של 0, 200, 400 ו-800 mg/kg BW/day, מוחלט ומשקל הכבד היחסי עלו באופן משמעותי בכל הקבוצות שטופלו משני המינים (לא מוצגים נתונים). בהתבסס על תוצאות אלו, בחרנו 2-(l-menthoxy) מינונים של אתנול של 0, 15, 60 ו-250 מ"ג/ק"ג BW ליום למתן הן לחולדות זכר והן לנקבה כיום 13- מחקר רעילות בשבוע

מצבים כלליים ותמותה הוערכו מדי יום. משקלי הגוף, כמו גם כמויות התזונה שסופקו ושאריות התזונה, נמדדו אחת לשבוע במהלך תקופת הניסוי. כל החולדות צמו בן לילה עם השלמת הטיפול, ודגימות דם להמטולוגיה וביוכימיה בסרום נאספו מאבי העורקים הבטן בהרדמה עמוקה בשאיפה באמצעות איזופלורן. תכנון המחקר היה בהתאם להנחיות לייעוד לתוספי מזון ותיקון התקנים לשימוש בתוספי מזון של יפן (1996) ואושר על ידי הוועדה לטיפול וניצול בעלי חיים של המכון הלאומי למדעי הבריאות, יפן.

המטולוגיה וביוכימיה בסרום

הפרמטרים ההמטולוגיים הבאים נותחו באמצעות מנתחי המטולוגיה אוטומטיים של ProCyte Dx (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, ארה"ב): ספירת תאי דם לבנים (WBC), ספירת תאי דם אדומים (RBC), ריכוז המוגלובין (HGB), המטוקריט (HCT), נפח גופי ממוצע (MCV), המוגלובין גופי ממוצע (MCH), ריכוז המוגלובין גופי ממוצע (MCHC), ספירת טסיות דם (PLT), ותאי לויקוציטים דיפרנציאליים, כולל נויטרופילים (Neut), לימפוציטים (לימפה), מונוציטים (מונו), אאוזינופילים (Eosino), ובזופילים (Baso). ניתוח ביוכימי בסרום בוצע על ידי Oriental Yeast עבור הפרמטרים הבאים: חלבון כולל (TP), אלבומין (Alb), יחס אלבומין/גלובולין (A/G), בילירובין כולל (Bil), גלוקוז, כולסטרול כולל (T-Chol), טריגליצרידים (TG), חנקן אוריאה (BUN), קריאטינין (Cre), סידן (Ca), זרחן אנאורגני (IP), נתרן (Na), אשלגן (K), כלור (Cl), אספרטאט אמינוטרנספראז (AST), אלנין aminotransferase (ALT), פוספטאז אלקליין (ALP), ו-glutamyl transpeptidase (-GTP).

משקלי איברים והערכה היסטופתולוגית

בוצעה נתיחה מלאה לכל בעלי החיים, ונשקלו המוח, התימוס, הריאות, הלב, הטחול, הכבד, בלוטות האדרנל, הכליות, האשכים והשחלות. איברים אלה, כמו גם רקמות מחוט השדרה, העצב המשולש, בלוטת יותרת המוח, חלל האף, בלוטות הרוק, הלשון, הוושט, קנה הנשימה, אבי העורקים, בלוטת התריס, בלוטת התריס, הלבלב, הקיבה, המעי הדק והגס, תת-הלסתני ומזנטרי. בלוטות לימפה, נרתיק, רחם, שלפוחית ​​השתן, בלוטת הערמונית, שלפוחית ​​זרע, אפידידימיס, עצם הירך ועצם החזה עם מח עצם, חוליות, שרירי שלד, עצב סיאטי, עור ובלוטת החלב, נקבעו ב-10% פורמלין מבוצר ניטרלי; לאחר מכן הוכנו קטעים משובצים בפרפין ונצבעו בהמטוקסילין ואאוזין לבדיקה היסטופתולוגית. האשכים והעיניים עם בלוטות הרדריאן נקבעו בתמיסת הקיבוע של בואין ובתמיסת דוידסון, בהתאמה. רקמות גרמיות, כולל חלל האף, החוליות, עצם החזה ועצם הירך, הוסרקו באמצעות תערובת של 10% חומצה פורמית ו-10% פורמלין מבוצר למשך עד שבועיים. הערכה היסטופתולוגית בוצעה עבור כל הרקמות שהתקבלו מבעלי חיים בקבוצת הביקורת והקבוצה קיבלה את המינון הגבוה ביותר, אלא אם כן נצפו נגעים הקשורים לטיפול.

אימונוהיסטוכימיה עבור 2u-גלובולין

בחולדות זכרים, הצטברות של 2u-גלובולין בכליה נבדקה על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי של קטעים משובצים בפרפין. לצורך החזרת אנטיגן, החתכים שהתקבלו מ-5 חולדות בכל קבוצה הודגרו עם פרוטאינז K (DAKO, Glostrup, דנמרק) למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. כל החלקים נטבלו בתמיסת 3% H2O2/מתנול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר לצורך ביטול פעילות פרוקסידאז אנדוגנית. לאחר חסימת תגובות לא ספציפיות עם 10% סרום ארנב תקין, החתכים הודגרו עם נוגדן ראשוני עבור 2u-גלובולין (מדולל 1:400; נוגדן 2u-גלובולין נגד חולדות; R&D Systems, Minneapolis, MN, ארה"ב) למשך הלילה ב-4 מעלות 8. הדמיה של קשירת נוגדנים בוצעה באמצעות ערכת Vecta Stain Elite ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA, ארה"ב) ו-3,3'-diaminobenzidine. כל הקטעים נצבעו נגדי בהמטוקסילין.

ניתוח סטטיסטי

שונות בערכי הנתונים עבור משקל הגוף במהלך תקופת הניסוי, כמו גם עבור המטולוגיה, ביוכימיה בסרום ומשקל איברים, הוערכו עבור הומוגניות באמצעות מבחן Bartlett. ניתוח חד-כיווני של שונות ומבחן Kruskal-Wallis, בהתאמה, הופעל עבור נתונים הומוגניים והטרוגניים. בקביעת הבדלים מובהקים סטטיסטית, נעשה שימוש במבחן ההשוואה המרובה של דנט כדי להשוות בין קבוצות ביקורת וטיפול. השוואות של שכיחות וציונים היסטופתולוגיים נותחו על ידי שימוש במבחן ההסתברות המדויק של פישר ובמבחן U של מאן-וויטני, בהתאמה. ערכי P של<0.05 were considered statistically significant.